ELISPOT para la detección de citocinas

ELISPOT detección de citocinas | Sefina Arif, King’s College, Londres, Reino Unido
Traducción: Jesús Gil, Würzburg, DE (SEI)

Fundamentos de la técnica

La prueba ELISPOT para detectar citocinas se basa en la técnica de inmunoabsorción ligado a enzima (ELISA) y está diseñada para detectar células secretoras de citocinas. Se caracteriza por ser muy sensible y, por ello, muy útil para detectar células secretoras poco frecuentes (hasta 1 entre 300,000). La liberación de citocinas en respuesta a un antígeno puede mapearse en una célula individual, por lo que puede calcularse la frecuencia de células T respondedoras. La información obtenida con esta prueba es tanto cuantitativa como cualitativa, ya que da información sobre el tipo de respuesta que ha sido producida. La principal aplicación es monitorizar respuestas inmunes tanto en humanos como en animales.

Como se lleva a cabo un ensayo de ELISPOT para la detección de citosinas

Una placa de poliestireno que permite fijar proteínas o PVDF es tapizada con un anticuerpo monoclonal anti-citocina de alta afinidad. Las células estimuladas con mitógeno o antígeno se añaden en los pocillos y son incubadas durante un periodo de tiempo específico, lo que permite que cualquier citocina secretada pueda ser capturada por el anticuerpo. Después de un lavado para eliminar las células y cualquier sustancia que no se haya unido, las citocinas pegadas se detectan utilizando un anticuerpo biotilinado y otro anticuerpo que reconoce a este último. El paso final es la precipitación, exponiendo los sitios de secreción de citocinas como un punto. Estos pueden contarse con un lector ELISPOT automatizado o manualmente utilizando un microscopio de disección. El procedimiento está resumido en la Figura 1.

1. ELISPOT assay citocine_Figure 1
Figura 1. Resumen del ensayo ELISPOT. Las células son estimuladas con antígeno o mitógeno durante 48 horas y posteriormente son transferidas a pocillos de placas que han sido tapizadas con un anticuerpo anti-citocina durante 18-22 horas. El siguiente paso es añadir un anticuerpo biotinilado anti-citocina seguido de un anticuerpo anti-biotina. Para finalizar, se añade el sustrato de la reacción que permitirá visualizar los puntos.

Aplicaciones

El ensayo ELISPOT para citocinas ha sido probado con éxito en distintas disciplinas de la inmunología. En el campo de los trasplantes de órganos, esta prueba permite monitorizar la frecuencia y el perfil de las células T reactivas circulantes del donante. En la investigación contra el cáncer se ha utilizado para medir la actividad CTL, mientras que en enfermedades infecciosas y desarrollo de vacunas, los ensayos han permitido medir las respuestas de memoria. Finalmente, en enfermedades autoinmunitarias, la sensibilidad de la técnica ha demostrado ser muy útil para detectar células autorreactivas que suelen aparece en muy baja frecuencia (Figura 2)

1. ELISPOT assay citocine_Figure 2
Figura 2. Respuesta de interferón gamma en diabetes de tipo 1. Respuestas de interferón gamma tras la administración del péptido autoantigénico proinsulina (izquierda) y la pentavacuna, Pediacel (derecha).

Su papel en la diabetes de tipo 1

En la diabetes de tipo 1 el ensayo ha sido utilizado para demostrar que las respuestas autorreactivas tras la estimulación con péptidos que contienen autoantígenos de los islotes pancreáticos (Figura 3) existen tanto en pacientes como en controles sanos. Sin embargo, en estos últimos la respuesta se caracteriza por ser predominantemente de tipo reguladora mediante la secreción de IL-10, mientras que en los diabéticos la respuesta es de tipo proinflamatoria, típicamente mediante la producción de interferón-γ. El ensayo ELISPOT también ha sido utilizado para monitorizar el equilibrio inflamación/células T reguladoras en pacientes sometidos a distintos ensayos clínicos con péptidos.

1. ELISPOT assay citocine_Figure 3
Figura 3. Respuestas de células T autorreactivas en diabetes de tipo 1. La polarización de respuestas de células T autorreactivas frente a péptidos de antígenos de las islas pancreáticas en pacientes con diabetes de tipo 1 (puntos rojos) y sujetos controles no diabéticos (triángulos azules).
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