Ensayo de inmunoabsorción ligado a enzima (ELISA)

Ensayo de inmunoabsorción ligado a enzima (ELISA) | Claire Horlock, Imperial College London, Reino Unido
Traducción: Jesús Gil, Würzburg, DE (SEI)

El ensayo de inmunoabsorción ligado a enzima (ELISA) es una técnica muy usada en inmunología para medir anticuerpos, antígenos, proteínas y glicoproteínas en muestras biológicas. Algunos ejemplos incluyen: diagnóstico de infección por VIH, test de embarazo, y medición de citocinas o receptores solubles en sobrenadantes celulares o suero. Generalmente se llevan a cabo en placas de 96 pocillos, lo que permite medir múltiples muestras en un único experimento. Estas placas deben tener propiedades especiales (ser absorbentes, como las NUNC) para asegurar que el anticuerpo o el antígeno se pegan a su superficie. Cada prueba mide un antígeno específico, existiendo una gran variedad de kits disponibles para distintos antígenos.

En la Figura 1 se puede observar un tipo de ELISA, llamado ELISA sandwich, donde se utilizan dos juegos de anticuerpos para detectar productos, como citocinas. El método se lleva a cabo en el orden mostrado. El primer paso es recubrir la placa ELISA con el anticuerpo de captura; cualquier anticuerpo en exceso o que no se haya unido se elimina después mediante lavado. Este anticuerpo está diseñado para reconocer el antígeno de interés.

2. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)_Figure 1
Figura 1. Ensayo ELISA. Lo que se muestra es un ELISA tipo sandwich, con los pasos de la prueba numerados del 1 al 4.

Después la muestra (ej. orina, suero o sobrenadante celular) es añadida. Cualquier antígeno que se encuentre en ella se unirá al anticuerpo de captura que recubre la placa. Las muestras suelen añadirse en duplicado o triplicado (para permitir análisis estadístico) y en distintas concentraciones para garantizar que puedan ser medidos con los niveles de detección de la prueba. De nuevo, cualquier excedente es eliminado de la placa usando un paso de lavado.

En el último paso, se añade el anticuerpo de detección, que suele estar marcado con una enzima, generalmente peroxidasa de rábano picante o fosfatasa alcalina. Este anticuerpo se unirá a los antígenos que estarán a su vez unidos al anticuerpo de captura. Para terminar, se añade una solución substrato. Las pruebas ELISA suelen ser cromógenas, es decir, se basan en una reacción que convierte el sustrato (ej. TMB o ABTS) en un producto coloreado que puede medirse utilizando un lector de placas.

Para determinar la concentración de antígeno en la muestra se requiere producir una curva estandar, utilizando antígenos en concentración conocida (mostrado en la Figura 2). La concentración del antígeno en la muestra se puede calcular utilizando la densidad óptica (OD).

2. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)_Figure 2
Figura 2. Curva éstandar típica. Se muestra una curva estandar para un ELISA que detecta IFNγ. Para determinar la concentración del antígeno en la muestra, la curva estandar se basa en usar una solución que contiene una concentración conocida del antígeno.
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