Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) | Tarnjit Khera, Universidad de Bristol, Reino Unido
Traducción: Jesús Gil, Würzburg, DE (SEI)

Antecedentes

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica fundamental de la biología molecular utilizada en distintas áreas como clonaje, análisis de la expresión génica (RT-PCR), estudios forenses y diagnóstico de enfermedades. Se trata de una técnica simple pero muy potente que permite producir una enorme cantidad de copias de ADN a partir de un número reducido de moléculas de ADN

Los componentes de la reacción (“mix”).

El primer paso en una PCR es sintetizar químicamente pequeñas moléculas de ADN de cadena simple llamadas primers (o cebadores), que son complementarios a las secuencias que flanquean a la secuencia de ADN de interés. Estos primers pueden diseñarse muy fácilmente mediante el uso de herramientas on-line. Así, una reacción de PCR está constituida por el ADN de interés (genómico, ADNc obtenido a partir de ARN…), un par de primers que complementan a las secuencias flanqueantes, la enzima ADN polimerasa para sintetizar el nuevo ADN y deoxirribonucleótidos trifosfato (dNTPs – dATP, dTTP, dGTP y dCTP), que son los “ladrillos” necesarios para sintetizar nuevas moléculas de ADN. Todos estos elementos se encuentran en una solución tamponada rica en sales.

La reacción

La PCR consta de tres pasos principales (Fig 1):

5. Polymerase Chain Reaction (Reacción en cadena de la polimerasa)_Figure 1

Desnaturalización: se calienta la mezcla a 95ºC durante 30s para desnaturalizar el ADN, lo que permite la formación de cadenas sencillas que servirán de molde para la síntesis de ADN.

Anillamiento: El “mix” es posteriormente enfriado entre 55 y 72ºC durante un corto periodo de tiempo (aprox. 30s). Esta temperatura varía en función de la secuencia del primer que estemos usando. Cuando la temperatura es óptima, los primers se alinean con la secuencia flanqueante.

Elongación: Este paso se lleva a cabo normalmente a 72ºC, la temperatura óptima para la ADN polimerasa. Durante este paso, esta enzima sintetiza una copia exacta de nuestra secuencia de interés a partir de los primers, usando para ello los dNTPs. La duración de este paso dependerá de la longitud de la secuencia que nos interese; cuanto más larga, más tiempo necesitará.

La cantidad de ADN presente en el mix se incrementará exponencialmente al final del paso 3. Estos tres pasos (llamados conjuntamente ciclos), se repiten utilizando un termociclador que calienta y enfría automáticamente de forma automática, generalmente entre 25 y 35 veces (dependerá de la cantidad de ADN inicial), lo que producirá un enorme número de copias idénticas. Estos productos pueden detectarse posterior-mente mediante electroforesis utilizando un gel de agarosa que contiene bromuro de etidio (Figura 2).
5. Polymerase Chain Reaction (Reacción en cadena de la polimerasa)_Figure 2
Revisión: Virginia Mas Bosch, Barcelona, ES (SEI)
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